冻存细胞

① 选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。

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② 按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×107／ml左右密度，离心，去上清。

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③ 加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

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④ 分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。

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⑤ 旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。

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⑥ 冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。

细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。

复苏细胞

① 从罐中取出冻存管。

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② 迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。

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③ 冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

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④ 低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。

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⑤ 用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。

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冻存细胞数量要充分，密度应达到107／ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5×105／ml数量

传代培养

① 吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

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② 向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

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③ 置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

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④ 吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。

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⑤ 使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

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⑥ 用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

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⑦ 细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。