A: 去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次；弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min；弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每T25瓶补足培养基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。
A: 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:4-1:8），每T25瓶加完全培养液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。
A: 一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污
A:胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。
不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录
A: 细胞传代或冻存时欲回收细胞，其离心速度一般为800-1000 rpm/min，室温离心5-8分钟，转速过高，容易造成细胞破裂而导致死亡。
A: 显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。
A:EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
A:不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。
A: 细胞传代后放入培养箱没有摇匀，或者放入时摇匀，但在细胞贴壁前，又移动了培养瓶，频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少，培养箱搁板表面不平整，这些因素会导致细胞生长不均匀。
A: 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。
A: 很可能是培养体系不适合细胞（未使用推荐的培养体系）；或者消化过度，对细胞有严重影响；或者是传代比例不合适（具有密度依赖性的细胞，传代太稀；或者生长较快的细胞，传代较密，细胞严重堆叠生长）。
A: 细胞增殖变慢有以下原因：
1. 消化过度
2. 传代过密
3.细胞营养不良
4.细胞频繁传代
5.细胞状态不佳或老化
6.细胞存在污染。
A: 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
A: 首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染；如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片（可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的），也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。
A: 掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代；掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片；减少血清等试剂的冻融次数；将培养液的PH调到最佳；严格控制水质和器皿的清洁。
Q:ChIP实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？
A:ChIP实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高，也较稳定，所以组蛋白研究起来更为容易，一般需要106-107个细胞即可完成一个ChIP反应。转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达，起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，建议使用超声断裂染色质的方法。因为酶法是化学处理，消化的位点往往比较均一，多是在核小体的连接处，酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合。
Q:染色质为什么要片段化？片段化的长度为什么是200-1000？片段化过度或不足对实验会有什么影响？
A:片段化的目的是确保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的，能被ChIP抗体接近；为确保ChIP实验有良好精度，一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linker DNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标
Q:什么是荧光素酶检测系统?如何使用荧光素酶报告基因载体?
A:将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。 1986 年萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得广泛的应用。在荧光素酶的催化下，虫荧光素被氧化并释放一个光子。可用荧光检测仪对荧光作定量测定。荧光素酶报告基因载体用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，可对启动子及增强子序列作快速及方便的分析。 pGL3系列载体，含 SV40 启动子及增强子的不同组合，有助于分析 DNA 片段的转录活性。具体情况如下：
pGL3-Basic 载体不含启动子及增强子，
Q:ChIP实验中需用ChIP级别抗体，没有ChIP级别抗体该怎么选择？对于特殊实验种属的ChiP抗体，该怎么选择？
A:由于ChIP级别（ChIP验证）过的抗体数量非常有限，所以当没有ChIP级别抗体时，我们有如下3种方法可以考虑：
（1）选择IP/IHC/ICC进行尝试，一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native，和ChIP抗体识别结构较为相似；不建议尝试Western blot抗体，因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature，并不适合ChIP实验；
（2）将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast，如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%，可以尝试跨物种抗体；
（3）可以使用标签抗体，但是标签页
Q:免疫沉淀过程中琼脂糖珠和磁珠有什么区别，哪一种Beads的效果更好呢？
A:在早期文献报道以琼脂糖珠为多，琼脂糖珠的优点是价格便宜，但是样本需离心，时间长，另外珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合，因此需要“预先清洗”染色质，除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显，样品容易丢失。
当前主流的方法是以磁珠方法较多，磁珠的好处是样本无须离心, 操作时间短，另外磁珠表面光滑，背景低，因此无需封闭。磁珠还有一个好处是带颜色，分层清晰，样品不会丢失，但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉淀是建议选择磁珠的方法。
Q:在免疫沉淀过程中Protein A和Protein G的beads的区别是什么，我该如何选择？不同种属的抗体抗体，有没有通用的beads进行选择？
A:蛋白 A微珠与兔多克隆抗体表现出最高的亲和力，而蛋白 G微珠与更广范围的抗体结合，包括大多数但并非全部种类的小鼠单克隆IgG。
当前还有一种Protein A/G 混合型磁珠，能够为免疫沉淀提供最大的灵活性，综合了蛋白 A和蛋白 G的结合特性，不用考虑不同种属IgG亲和力差异。此外，蛋白 A/G混合物通常比单独使用蛋白 A或G富集的倍数更高，产生的背景更低。因此在免疫沉淀时建议使用A/G混合型磁珠。
Q:免疫沉淀的时候，我的样本、抗体和磁珠加样和反应顺序对实验结果有什么影响？有要求吗？
A:一般有3种反应顺序：
染色质样本+抗体先反应，然后加磁珠；
抗体+磁珠先反应，然后加染色质抗体；
染色质样本+抗体+磁珠 三者同时反应。
无论选择哪种微珠，使用磁珠或琼脂糖珠的顺序可能影响您的ChIP信号。
第一种方法先将微珠与捕获抗体共同孵育（室温下几小时，或4°C过夜），接着加入染色质（样本），继续孵育（4°C震荡孵育1小时至过夜）。增加孵育时间有可能增加背景和ChIP信号；然而，与靶点亲和力低的抗体即使延长（过夜）孵育，也不产生明显的ChIP信号。
第二种方法将抗体与染色质样本
Q:ChIP实验中最关键的结果是什么？什么样的富集倍数被认为是阳性的结果？
A:ChIP实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA结合能力的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA 结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体，另一个是阴性抗体（和特异性抗体同种属的lgG）验证抗体是否有非特异性的结合，然后将这两个抗体获得的DNA进行比较，得到一个比值
Q: ChIP实验中DNA的检测在什么情况下用PCR反应？什么情况下用测序？
A:当检测已知蛋白结合的DNA序列的时候，可以使用PCR反应进行检测，PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法，在PCR的时候除了样本组外，还需要设置input 对照，阴性对照和空白对照。PCR扩增片段长度200-400bp最佳，模板DNA片段过长，结合位点的邻近DNA会出现一定程度的信号富集。
但是有些情况下，蛋白结合的DNA序列是未知的，这时我们需要使用ChIP结合测序（Seq）方法检测，ChIP-Seq一般包括3个步骤：ChIP反应，文库构建和测序。一般有两种方法操作，一种使用普通
