在体外无细胞系统中，用双链DNA中确定的一条链作为模板，以A、U、C、G四种核糖核苷酸为原料，在含有RNA转录酶等条件，模仿体内转录过程生成RNA，该技术被称为体外转录。RNA体外转录常用的启动子包括T7启动子、T3启动子和SP6启动子。这些启动子能够指导RNA聚合酶识别并结合到DNA模板上，从而启动RNA的合成。
T7启动子是体外转录中最常用的启动子之一，它的核心序列为TAATACGACTCACTATAGGG，转录起始位点为GGG，T7 RNA聚合酶转录出的mRNA的5'端会突出3个碱基GGG。
sp6启动子是另一个常用的体外转录启动子，其核心序列为ATTTAGGTGACACTATAG，sp6启动子的转录起始位点为G，因此转录出的mRNA的5'端会突出1个碱基。
目前较常用的是运用T7启动子体外转录法，制备含T7启动子的目标DNA模板，可通过PCR或全基因合成方法获得，PCR扩增获取含有T7 promoter序列的正义链和反义链DNA，其引物设计规则如下：
探针类型 | 引物名称 | 引物序列 |
正义链探针 | 正义链-上游引物 | 5’- TAATACGACTCACTATAGGG+目的基因上游引物-3’ |
正义链-下游引物 | 5’- 目的基因下游引物 -3’ | |
反义链探针 | 反义链-上游引物 | 5’- 目的基因上游引物 -3’ |
反义链-下游引物 | 5’- TAATACGACTCACTATAGGG+目的基因下游引物 -3’ |
如NR_045262.2 Homo sapiens prostate cancer associated transcript 1 (PCAT1), long non-coding RNA，其引物设计如下：
正义链引物
PCAT1-F:TAATACGACTCACTATAGGG ACACATGGATATTGGATATCTGC
PCAT1-R: TAGGCTCAAACACACATT
反义链引物
Anti-PCAT1-F:ACACATGGATATTGGATATCTGC
Anti-PCAT1-R: TAATACGACTCACTATAGGG TAGGCTCAAACACACATT
以目的基因的质粒/PCR产物为模板，PCR扩增分别获得T7-正义链全长基因片段和T7-反义链全长基因片段的DNA模板，可通过DNA回收试剂盒经琼脂糖凝胶进行回收，纯化,具体操作步骤可根据说明书进行。
（1）生物素标记RNA可使用体外转录试剂盒进行反应获取生物素标记的RNA。以上述DNA为模板，按照自备的RNA体外转录试剂盒说明书配置反应体系，以Invitrogen 货号为AM1344 的T7体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE® Kit 为例，配置以下体系：
组分 | 用量 |
10*Reaction Buffer | 2 μL |
10*Biotin RNA labeling Mix | 2 μL |
DNA模板 | 0.5 μg |
T7 RNA Polymerase Enzyme Mix | 2 μL |
RNase-free H2O | Up to 20 μL |
37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min将DNA模板消化，得到正义和反义RNA。
* 注意：该体系和步骤可能因转录试剂盒的不同而有所差别，请务必根据试剂盒说明书操作。
（2）再加入DNase I酶，将DNA模板消化,根据说明书进行。
（3）最后，再将转录产物用RAN纯化试剂盒试剂盒纯化.
(4)取 2 μL对 RNA 检测浓度；取1~2 μL RNA进行 2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和长度；符合要求的RNA置于- 80℃保存或直接用于后续实验。
