● 技术原理

       CRISPR-Cas9系统的核心在于sgRNA引导Cas9蛋白对特定基因序列进行精准识别和切割。CRISPR-Cas9基因敲除系统通过Cas9内切酶切割双链DNA后，生物体主要启动NHEJ修复途径（非同源末端连接）。NHEJ修复机制是一种错误倾向的修复方式。在DNA发生双链断裂时，该修复途径被激活，在DNA断裂处随机插入或缺失几个碱基，然后将切割末端连接起来。这一过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而破坏基因的开放阅读框，导致无意义介导的mRNA降解，最终实现基因沉默。对于编码基因的敲除，gRNA通常应靶向基因的N端区域，以确保最大程度地破坏基因功能。

● 实验流程

sgRNA设计与载体构建：针对目标基因序列设计特异性的sgRNA，通常针对每个基因设计3种以上sgRNA，并通过软件分析确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。然后将选择的sgRNA设计克隆到适当的载体中.

细胞转染：应用电转方法转染质粒。

细胞筛选：若使用带抗性标记的质粒，可在转染48小时后加药筛选。

单克隆分离与扩增：获得遗传背景一致的细胞群。将富集后的细胞通过有限稀释法接种到96孔板，确保每孔理论上有0.5-1个细胞，培养数周直至形成肉眼可见的单克隆。基因敲除验证：必须对单克隆进行多层级验证。

基因组DNA水平：提取单克隆基因组DNA，在靶点区域进行PCR扩增并测序，确认Indel序列及是否为纯合敲除。对于双sgRNA删除大片段的策略，需用跨删除区域的引物进行PCR，通过条带大小判断。

蛋白质水平：通过Western Blot检测目标蛋白是否完全缺失，这是功能敲除的直接证据

●技术优势

编辑效率高：CRISPR-Cas9系统通过优化的sgRNA设计和递送系统，能够实现高效的基因编辑。特别是在使用慢病毒载体的情况下，转染效率显著提高。

应用范围广：该技术适用于各种类型的细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞等，广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建及药物开发等领域。在临床前研究中，CRISPR-Cas9已被用于遗传疾病校正、病毒复制抑制及多种癌症的个性化靶向治疗。

操作相对简便：与传统基因 targeting 技术相比，CRISPR-Cas9系统设计简单、成本较低、周期较短，使得更多实验室能够应用这一技术。

●应用领域

基础科学研究：在基因功能研究方面，基因敲除细胞株是探究基因功能最直接有效的工具之一。通过观察特定基因敲除后细胞的表型变化，可以推断该基因的生物学功能。

疾病模型构建：基因敲除细胞株为人类疾病研究提供了重要的体外模型。研究人员可以利用这些模型研究疾病发生机制，筛选潜在治疗药物。

生物技术创新：在生物技术领域，基因敲除细胞株已用于优化细胞工厂性能。例如，通过 glycoengineering 对CHO细胞进行基因敲除，可以改善重组蛋白的糖基化 profile，提高生物药物的质量和效能。

细胞治疗开发：在免疫治疗领域，CRISPR-Cas9技术被用于开发同种异体CAR-T细胞。通过敲除T细胞表面的HLA分子，减少移植物抗宿主病，同时保留HLA-C以保护来自NK细胞的排斥。