RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA结合蛋白免疫沉淀)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络过程中的有力工具。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的抗原蛋白-RNA复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行qPCR或者RIP-Seq分析。RIP-Seq将RIP技术与高通量测序相结合,能够高通量地检测与特定蛋白结合的RNA。
目的蛋白的抗体结合于磁珠上,与细胞内的抗原蛋白-RNA复合物孵育,由于抗原抗体的作用,会形成磁珠-抗体-抗原蛋白-RNA的复合体,通过磁珠讲该复合体拉下来后,经过洗脱获取抗原蛋白-RNA产物,该产物经过RNA纯化后即可获取到诱饵蛋白结合的RNA。
● 实验原理流程图 ●
● 实验方法 ●
①收集足够量的细胞/组织;
②裂解细胞,提取蛋白-RNA复合物;
③IP抗体与protein A/G磁珠结合,免疫共沉淀抗原蛋白;
④ 洗涤结合的杂质;
⑤蛋白酶K消化蛋白,提取RNA并进行RNA 逆转录;
⑥结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
● 案例展示 ●
研究细胞内RNA与蛋白结合情况;
发现RNA结合蛋白(RBP)与非编码RNA(LncRNA、miRNA、circRNA等)的相互作用;
研究RNA结合蛋白(RBP)参与mRNA的转录和成熟包括加工、转运、稳定、降解和翻译等生物过程;
研究转录后调控研究、表观遗传调控;
研究mRNA分子在转录后水平受到核糖核蛋白复合体(RNP)的调节。