microRNA(miRNA)是一类分布十分广泛的小调控RNA基因，它们基于与靶 mRNA 的序列互补，可以降解靶 mRNA 和抑制蛋白质翻译。miRNA可能在多种生物的不同生物系统都起着关键作用，越来越多的证据表明miRNA与多种生物学过程相关，然而多数的miRNA调控的具体细节还很不清楚。虽然一些miRNA靶基因已经被实验证实，但是它们精确的结合位点还很不清楚，我们期望在不远的将来有更多的miRNA调控的基因被鉴定出来。接下来我们主要介绍最常用的miRNA靶点关系验证方法：双荧光素酶报告基因检测。

■ 实验原理

     双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase®）是指同时检测萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，F-Luc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，R-Luc)的活性，先以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾荧光素酶，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾荧光素酶的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。

    miRNA主要是作用于靶基因的3’UTR起作用，将目的基因3’UTR序列构建至报告基因F-Luc载体中的3’端，通过与过表达miRNA比较后，报告基因荧光值的改变来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

■ 实验材料

实验试剂：双荧光素酶报告系统检测试剂盒，完全培养基、细胞、靶基因双荧光素酶报告基因质粒

实验耗材和仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪、枪头、酶标仪、细胞培养板

■ 实验方法

microRNA与质粒共转染细胞

(1) 细胞铺板：

a. 转染前一天，细胞按2×104个/孔接种于24孔板上,培养基为含10%FBS的完全培养基；

b. 转染当天，细胞汇合度约为60-70%，吸去旧的培养基，用PBS洗涤两次，然后每孔加入300μL OPTI-MEM培养基，置于5% CO2、37℃培养箱中；

(2) 转染：

a. 每个孔用OPTI-MEM培养基稀释lipofectamine2000 1μL，终体积为50μL，室温下静置5min；

b. 每个孔加入终浓度为100nM的microRNA和0.5ug质粒溶解到50μL的OPTI-MEM中，室温下静置5min；

c. 将转染试剂加入至质粒和miRNA复合物中，轻轻吹吸混匀，室温下静置20min；

d. 在24孔板中每孔加入100μL中的转染复合液，稍加晃动混匀；

(3) 培养：细胞板置于5% CO2、37℃培养箱中培养，孵育4-6h后更换新鲜的完全培养基（含血清）替换含有转染复合物的培养基。

荧光素酶活性检测

用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System （E1910）进行样品Luciferase活性检测。

（1）转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗洗两次；

（2）5xPLB 裂解液加灭菌去离子水稀释成1xPLB 裂解液；

（3）每个孔加入100ul 稀释好的1xPLB，摇床常温条件下摇晃15min 进行裂解；

（4）用细胞刮刮起细胞，收集裂解液到EP 管中，13000rpm 4℃离心 1min，将上清转移到新的管子中。

（5）避光条件下，96 孔酶标版中加入收集好的上清20ul ，加入100ul LARII，混匀，放到机器上测定数据，检测萤火虫荧光素酶；

（6）每孔加入100ul 的STOP&GLO Reagent，测定数据，检测海参荧光素酶的活性。