‖技术概述

      环境 DNA 宏条形码测序（environmental DNA metabarcoding, eDNA metabarcoding）是一种基于环境样本中游离 DNA 的物种多样性检测技术。该技术通过采集水体、土壤、沉积物等环境介质，提取其中由生物体释放的 DNA，利用通用引物对特定条形码基因进行扩增，并结合高通量测序与生物信息学分析，实现生物群落组成的无创、高通量鉴定。生物体在生命活动过程中会持续向周围环境释放 DNA，来源包括表皮细胞脱落、黏液、排泄物、生殖细胞、鳞片、花粉及孢子等。这些游离于水体、土壤、沉积物或空气中的 DNA 统称为环境 DNA。由于环境 DNA 在外界条件下易降解，其在自然介质中的半衰期通常仅为数小时至数天，因此检测结果能够反映采样时段内的生物存在信息。

      DNA 条形码（DNA barcoding）指利用基因组中具有物种特异性的短片段对物种进行鉴定的方法。宏条形码技术在此基础上，采用一对通用引物对样本中全部目标类群的条形码片段进行混合扩增，借助高通量测序平台完成大规模并行测序，最终通过序列比对实现多物种的同步鉴定。其技术路径可概括为：环境采样 → 通用引物扩增 → 高通量测序 → 生物信息学比对。

‖条形码基因选择

‖技术路线与实验流程

① 现场采样与样品保存

水体样本通常每点位采集 0.5～2 L，经 0.22～0.45 μm 孔径滤膜负压过滤，将环境 DNA 富集于滤膜；土壤与沉积物样本直接取表层样品分装。采样环节的核心质控要求包括：每批次设置野外空白与试剂空白对照；采样器具一次性使用或经次氯酸钠溶液处理后复用，以杜绝交叉污染。滤膜可加入保存缓冲液或经干冰 冷冻保存，应避免反复冻融。

② 环境 DNA 提取

环境样本富含腐殖酸、腐殖质、多糖等 PCR 抑制剂，是导致扩增失败的主要原因。提取环节应采用抗抑制剂型试剂盒，并通过 NanoDrop 或荧光定量仪（Qubit）对 DNA 浓度与纯度进行质检。

③ PCR 扩增与文库构建

以通用引物扩增目标条形码片段，多采用两步 PCR 策略：第一轮 PCR 在引物 5′端引入通用接头，第二轮 PCR 引入带样本标签（index）的测序接头，实现多样本混合测序。每个样本应设置不少于 3 个 PCR 重复，并设置不含模板的阴性对照。

④ 高通量测序

文库经纯化、定量与混合后上机测序。平台为 Illumina MiSeq/NovaSeq 系列（PE250/PE300 双端测序），适用于短片段扩增子；纳米孔测序（Oxford Nanopore）技术的引入则使野外现场、近实时测序成为可能。单样本有效 reads 通常需达到数万至数十万条，以保证低丰度物种的检出。

⑤ 生物信息学分析

生信流程包括：测序数据质控与接头去除（fastp、Trimmomatic）→ 序列去噪生成扩增子序列变异（ASV，如 DADA2）或按 97% 相似度聚类为操作分类单元（OTU，如 VSEARCH）→ 嵌合体去除 → 与参考数据库比对注释（鱼类常用 MIDORI、GenBank、BOLD；细菌常用 Silva、Greengenes；真菌常用 UNITE）→ 下游 α/β 多样性、群落结构及指示物种分析。

‖典型应用