Western blot图片排版及条带分析方法
实验干货 分享
2023-05-31
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    Western blot免疫印迹(以下简称WB)实验作为检测蛋白表达相对定量的技术,在完成Western blot实验后,得到的是蛋白条带,还需要再对Western blot条带进行结果处理。对于WB结果处理的过程,主要分为3个部分:

1.    用PS软件进行排版;

2.    用image J进行灰度值分析;

3.    用prism软件进行作图分析。

 

一、 用PS对WB图片排版

1.    打开PS软件,如下图需要处理β-actin蛋白和Xprotein蛋白,将WB灰度图一起拉到PS中 :

图片1.jpg


2.    有一些条带会出现倾斜的情况,会影响美观,因此我们需要将条带拉直至在在同一水平线上。选择【标尺工具】,对着WB条带的首尾画一条直线,接着点击【拉直图层】,图片即可呈现水平状态。

图片2.jpg

拉直后的wb条带图

图片3.jpg

拉直后的wb条带图


3.    在不改变台条带趋势的情况下,可以对条带进行曝光度调整(图像-调整-曝光度);

图片4.jpg


4.    新建画布,点击文件-新建画布即可新建。新建大小可以根据PS的默认大小来新建,也可以自己自定义画布大小。

图片5.jpg


5.    点击【矩形选择框工具】-选中条带,点击【移动工具】,点击选中的条带,将条带拖至新建的画布中(或者复制选中的条带后,再到新建画布中粘贴也可以)。

图片6.jpg

 

6.    同样的方法,我们可以将第二个条带或第三个条带拖新建的画布中,快捷方式ctrl+t可以调整图片大小,拖动图片使图片条带对齐即可。下图的图层1和图层2对应的是拉进来的2个蛋白图。

图片7.jpg

 

7.    描边。选择对应的蛋白条带图后,点击编辑-描边,这里选择1像素,选择太高像素边框会加粗。

图片8.jpg


8.    最后标注就可以了。点击文字工具,可以选择选择横排文具工具或者竖排文字工具,选择合适的字体大小,再在需要标注的单击即可进行文字编辑。

图片9.jpg


9.    调整图片大小,保存图片。如图画布太大,可以通过裁剪工具裁掉一部分的画布,最后通过“文件“-”储存为“,选择对应的图片格式保存图片。

图片10.jpg

 


二、 灰度值分析

1. 打开image J软件,打开以上排版好的WB图;

2. 转为灰度图片:点击image- type-8 bit

3. 设计参数:点击analysis-set measurments

图片11.png

4. 设计单位:点击analysis-set scale ,选择pixel单位

图片12.png

 

5. 分析条带:选择矩形选框工具,框住条带,点击Analysis-Gels-Selecit First Lane(或快捷键control +1)

图片13.png

 

6. 再次点击Analysis-Gels-Plot Lanes(或快捷键control +3)

图片14.png


7. 封闭开口:选择直线工具,画下直线,将开口封住

图片15.png


10.  得出数据:选择魔棒工具,依次点击各个框,即可得到相对应的灰度值数据

图片16.jpg


11.  复制数值至excel 表格。



三、 数据分析

1.    对于我们得到的数据,可以将目的蛋白的条带数值/内参条带的数值,再将得出的数值以对照组数据为参考做均一化处理,即可得到表达趋势值。

2.    我们可以将得到的数值标注在wb条带的下方,如果进行了3次重复实验,也可以通过prism软件进行数据处理,做成柱状图并进行统计学分析。对于分析方法,可以参考纽万生物发表的《运用Graphpad prism软件绘制柱状图》文章。

 


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