◆ 技术简介
启动子能特异性识别与RNA聚合酶结合，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性；转录因子（TFs）调节基因表达，保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。荧光素酶是自然中能够产生生物荧光的酶，其最有代表性的就算萤火虫荧光素酶（firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（ Renilla Luciferase ）。在荧光素酶的催化下，荧光素底物发生氧化反应，从而产生荧光。通常其中一个荧光素酶基因作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响，比如细胞数目及活力的差异，细胞转染及裂解效率。
结合双荧光素酶报告系统，将启动子DNA序列插入到报告基因载体（常用载体为pGL3-Basic Vector，将待检测的启动子序列构建在报告基因上游），若该DNA片段具有启动子活性，则可以测到相应的双荧光素酶荧光值。
◆ 实验方法
1. 启动子报告基因载体构建：将目的基因构建至双荧光素酶报告基因载体的上，目的片段位于荧光素酶报告基因的上游，如构建至pGL3-basic。
2. 转染细胞：将荧光素酶报告质粒与内参报告质粒和共转染目的细胞，由于内参的启动子活性较强，通常报告质粒与内参质粒的转染比例为10:1。
3.收集细胞:将裂解液加入细胞孔中，摇床常温条件下摇晃适当时间后进行离心，将上清转移到新的管子中。
4.双荧光素酶报告基因活性检测:96 孔酶标版中加入20 ul细胞裂解液上清，加入100UILARI，混匀，读取读数，即为Firefly luciferase的数值;每孔再加入100ul 的STOP&GLO Reagent，再次测定数据，即为Renila luciferase的数值。
5.数据处理:首先将Firefly luciferase/Renila luciferase得出比值，即可得到不同处理组的相对luciferase活性。
◆ 技术应用
NO.1 | NO.2 | NO.3 |
检测启动子的活性 | 分析启动子结构。选择转录起始位点上有2kb的片段，对 DNA片段截断，或者对位点进行突变，插入报告基因载体， 结合荧光素酶检测，可以分析出某片段或者某位点的活性. | 验证特定转录因子的调控作用。通过将转录因子表达载体 与启动子报告基因载体共转染细胞后检测其双荧光素酶的 活性，来判断该转录因子是否具有调控作用。 |
◆ 服务内容
服务类型 | 客户提供 | 服务内容 | 周期 | 价格 |
双荧光素酶报告基因 （启动子活性分析） |
ü 启动子信息（名称、物种、序列） ü 启动子基因模板（或委托我司合成/克隆） ü 实验用细胞（若选用293T细胞无需提供） ü 实验信息表
| ² 启动子载体构建 ² 细胞转染 ² 双荧光素酶活性检测 ² 出具实验报告 | 5-6周 | |
双荧光素酶报告基因 （分析启动子结构） | ü 启动子信息（名称、物种、序列） ü 启动子基因模板（或委托我司合成/克隆） ü 实验用细胞（若选用293T细胞无需提供） ü 实验信息表
| ² 启动子载体构建 ² 启动子DNA片段截短载体构建 ² 细胞转染 ² 双荧光素酶活性检测 ² 出具实验报告 | 5-6周 | |
双荧光素酶报告基因 （转录因子调控分析） | ü 启动子信息（名称、物种、序列） ü 启动子基因模板（或委托我司合成/克隆） ü 转录因子表达载体（或委托我司构建） ü 实验用细胞（若选用293T细胞无需提供） ü 实验信息表
| ² 启动子载体构建 ² （选做）转录因子表达载体构建 ² 细胞转染 ² 双荧光素酶活性检测 ² 出具实验报告 | 5-6周 |
◆ 结果展示
