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双荧光素酶报告基因检测启动子活性
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◆ 技术简介 


       启动子能特异性识别与RNA聚合酶结合,使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性;转录因子(TFs)调节基因表达,保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

       荧光素酶是自然中能够产生生物荧光的酶,其最有代表性的就算萤火虫荧光素酶(firefly Luciferase)和海肾荧光素酶( Renilla Luciferase )。在荧光素酶的催化下,荧光素底物发生氧化反应,从而产生荧光。通常其中一个荧光素酶基因作为报告基因,用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个作为内参对照,即表达量基本恒定,用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响,比如细胞数目及活力的差异,细胞转染及裂解效率。

       结合双荧光素酶报告系统,将启动子DNA序列插入到报告基因载体(常用载体为pGL3-Basic Vector,将待检测的启动子序列构建在报告基因上游),若该DNA片段具有启动子活性,则可以测到相应的双荧光素酶荧光值。              



   

◆ 实验原理 


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◆ 实验方法 

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◆ 结果展示 


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◆ 应用 


检测启动子的活性;

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验证特定转录因子的调控作用。通过将转录因子表达载体与启动子报告基因载体共转染细胞后检测其双荧光素酶的活性,来判断该转录因子是否具有调控作用。

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分析启动子结构。通常会选择转录起始位点上有2kb的片段,通过对DNA片段的截断,或者对位点进行突变,插入报告基因载体,结合荧光素酶检测,可以分析出某片段或者某位点的活性;

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