细胞凋亡介绍

       细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。在生物体进化、内环境的稳定以及发育过程中起着重要作用，具有重要生物学意义及复杂的分子生物学机制。

在生物学研究过程中常常需要检测细胞凋亡情况。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法，大致可分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。每一方法都有其优缺点，需要根据实际情况选择适合的细胞凋亡检测方法。

基于细胞形态的方法：如电子显微镜观察法、细胞核形态染色法

基于生物学功能的方法：如Annexin-V/PI双染法、线粒体膜电位变化检测；

基于生化标记的方法：Caspase-3活性检测、DNA损伤检测、TUNEL法（DNA片断原位标记法）

这里主要讲述Annexin-V/PI双染法。

 Annexin-V/PI双染法技术简介

       磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。将荧光标记（FITC、PE或 biotin）的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。PI不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来（Annexin-V/PI法）。Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前检测细胞凋亡的一种方法。

实验方法

①

细胞样本于1000rpm离心5min，弃上清；

②

PBS重悬洗涤两次，于1000rpm离心5min，弃上清，加入500μl 1X Annexin V buffer轻轻重悬细胞；

③

 加入5μl Annexin V-FITC 和5μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀；

④

 室温(20-25℃)避光孵育15min。可以使用铝箔进行避光；

⑤

随即进行流式细胞仪检测。

结果案例

结果说明：

（1）左上象限：FITC-/PI+，为机械损伤细胞;

（2）左下象限：FITC-/PI-，为活细胞；

（3）右上象限：FITC+/PI+，为非活细胞,即坏死细胞或晚期凋亡细胞;

（4）右下象限：FITC+/PI-，为早期凋亡细胞；

实验类型

服务流程