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【常见问题解答】 【产品说明书】 【样本制备和送样说明】 【 实验干货 分享】
常见问题解答
Q:贴壁细胞如何进行传代?
A: 去掉原T25培养瓶里面的培养基,T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS,再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞,显微镜下观察,待细胞变圆,细胞间隙明显,部分细胞刚开始脱离瓶壁,加4 ml左右完全培养液混匀终止消化,将细胞小心吹打下来,1000 rpm/min室温离心5min;弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每T25瓶补足培养基至5-6 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。
Q:悬浮性细胞应如何传代处理?
A: 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,将细胞悬液移入离心管中,1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8),每T25瓶加完全培养液至4-5 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长,此时细胞生长状态良好,当补液时,需避免反复吹打。
Q:贴壁细胞传代如何使用胰酶?
A: 一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣子增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污
Q:如何控制胰酶消化时间?
A:胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度细胞碎片增多,黑渣子增多,细胞会成片脱落,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。 不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录
Q:细胞离心下来的离心速率应为多少?
A: 细胞传代或冻存时欲回收细胞,其离心速度一般为800-1000 rpm/min,室温离心5-8分钟,转速过高,容易造成细胞破裂而导致死亡。
Q:如何区分活细胞和死细胞?
A: 显微镜下观察:活细胞中间透亮,饱满,有光泽,死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。
Q:使用胰蛋白酶加入EDTA是为什么?
A:EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
Q:可否使用与原先不同的培养基?
A:不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,易造成细胞状态不好,最终造成细胞无法存活。
Q:细胞为何生长不均匀?
A: 细胞传代后放入培养箱没有摇匀,或者放入时摇匀,但在细胞贴壁前,又移动了培养瓶,频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少,培养箱搁板表面不平整,这些因素会导致细胞生长不均匀。
Q:购买的细胞死亡或细胞存活率不佳
A: 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。
Q:细胞传两代后开始逐渐死亡的原因
A: 很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系);或者消化过度,对细胞有严重影响;或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞,传代太稀;或者生长较快的细胞,传代较密,细胞严重堆叠生长)。
Q:细胞生长逐渐变慢是什么原因?
A: 细胞增殖变慢有以下原因: 1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。
Q:培养细胞时应使用5%或10%CO2?
A: 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时,则应使用5% CO2培养细胞。
Q:培养中常出现一些黑点,是污染吗?
A: 首先肉眼观察培养液是否变浑浊,如果变浑浊,基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊:在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则,是否运动,是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则,做布朗运动,黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的),也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的,也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致,快速移动,很可能是细菌污染。
Q:如何预防细胞培养中黑点的产生?
A: 掌握细胞传代的最佳时机,不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间,防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。
Q:ChIP实验研究转录因子,调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么?
A:ChIP实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高,也较稳定,所以组蛋白研究起来更为容易,一般需要106-107个细胞即可完成一个ChIP反应。转录调控因子表达水平很低,往往是瞬时表达,起始样本量(细胞,组织)要是组蛋白的10倍,一般每个反应至少需要107个细胞。另外有些转录因子比较大,往往结合多个核小体,因此在染色质断裂的时候,建议使用超声断裂染色质的方法。因为酶法是化学处理,消化的位点往往比较均一,多是在核小体的连接处,酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合。
Q:染色质为什么要片段化?片段化的长度为什么是200-1000?片段化过度或不足对实验会有什么影响?
A:片段化的目的是确保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的,能被ChIP抗体接近;为确保ChIP实验有良好精度,一般片段化的大小在200-1000bp,一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话,蛋白的结合位点很有可能被打断,原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp,加上不同核小体间的linker DNA序列,这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右,如果片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含目标序列的DNA,但所要研究的蛋白可能会离您目标
Q:什么是荧光素酶检测系统?如何使用荧光素酶报告基因载体?
A:将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中,可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。 1986 年萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因,获得广泛的应用。在荧光素酶的催化下,虫荧光素被氧化并释放一个光子。可用荧光检测仪对荧光作定量测定。荧光素酶报告基因载体用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因,可对启动子及增强子序列作快速及方便的分析。 pGL3系列载体,含 SV40 启动子及增强子的不同组合,有助于分析 DNA 片段的转录活性。具体情况如下:  pGL3-Basic 载体不含启动子及增强子,
Q:ChIP实验中需用ChIP级别抗体,没有ChIP级别抗体该怎么选择?对于特殊实验种属的ChiP抗体,该怎么选择?
A:由于ChIP级别(ChIP验证)过的抗体数量非常有限,所以当没有ChIP级别抗体时,我们有如下3种方法可以考虑: (1)选择IP/IHC/ICC进行尝试,一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native,和ChIP抗体识别结构较为相似;不建议尝试Western blot抗体,因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature,并不适合ChIP实验; (2)将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast,如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%,可以尝试跨物种抗体; (3)可以使用标签抗体,但是标签页
Q:免疫沉淀过程中琼脂糖珠和磁珠有什么区别,哪一种Beads的效果更好呢?
A:在早期文献报道以琼脂糖珠为多,琼脂糖珠的优点是价格便宜,但是样本需离心,时间长,另外珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合,因此需要“预先清洗”染色质,除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显,样品容易丢失。 当前主流的方法是以磁珠方法较多,磁珠的好处是样本无须离心, 操作时间短,另外磁珠表面光滑,背景低,因此无需封闭。磁珠还有一个好处是带颜色,分层清晰,样品不会丢失,但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉淀是建议选择磁珠的方法。
Q:在免疫沉淀过程中Protein A和Protein G的beads的区别是什么,我该如何选择?不同种属的抗体抗体,有没有通用的beads进行选择?
A:蛋白 A微珠与兔多克隆抗体表现出最高的亲和力,而蛋白 G微珠与更广范围的抗体结合,包括大多数但并非全部种类的小鼠单克隆IgG。 当前还有一种Protein A/G 混合型磁珠,能够为免疫沉淀提供最大的灵活性,综合了蛋白 A和蛋白 G的结合特性,不用考虑不同种属IgG亲和力差异。此外,蛋白 A/G混合物通常比单独使用蛋白 A或G富集的倍数更高,产生的背景更低。因此在免疫沉淀时建议使用A/G混合型磁珠。
Q:免疫沉淀的时候,我的样本、抗体和磁珠加样和反应顺序对实验结果有什么影响?有要求吗?
A:一般有3种反应顺序: 染色质样本+抗体先反应,然后加磁珠; 抗体+磁珠先反应,然后加染色质抗体; 染色质样本+抗体+磁珠 三者同时反应。 无论选择哪种微珠,使用磁珠或琼脂糖珠的顺序可能影响您的ChIP信号。 第一种方法先将微珠与捕获抗体共同孵育(室温下几小时,或4°C过夜),接着加入染色质(样本),继续孵育(4°C震荡孵育1小时至过夜)。增加孵育时间有可能增加背景和ChIP信号;然而,与靶点亲和力低的抗体即使延长(过夜)孵育,也不产生明显的ChIP信号。 第二种方法将抗体与染色质样本
Q:ChIP实验中最关键的结果是什么?什么样的富集倍数被认为是阳性的结果?
A:ChIP实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA结合能力的实验。因此结果一般包括两个数据:免疫沉淀的效率(富集效率), 蛋白与DNA 结合能力(富集倍数)。但是这两个结果本身都是一个相对值,因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分,一部分进行免疫沉淀,一部分作为对照不进行免疫沉淀,然后两者进行比较,得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀,一个是特异性的抗体,另一个是阴性抗体(和特异性抗体同种属的lgG)验证抗体是否有非特异性的结合,然后将这两个抗体获得的DNA进行比较,得到一个比值
Q: ChIP实验中DNA的检测在什么情况下用PCR反应?什么情况下用测序?
A:当检测已知蛋白结合的DNA序列的时候,可以使用PCR反应进行检测,PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法,在PCR的时候除了样本组外,还需要设置input 对照,阴性对照和空白对照。PCR扩增片段长度200-400bp最佳,模板DNA片段过长,结合位点的邻近DNA会出现一定程度的信号富集。 但是有些情况下,蛋白结合的DNA序列是未知的,这时我们需要使用ChIP结合测序(Seq)方法检测,ChIP-Seq一般包括3个步骤:ChIP反应,文库构建和测序。一般有两种方法操作,一种使用普通
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质粒菌液产品说明书
2023-05-06
样本制备和送样说明
qPCR实验送样说明
2023-05-06
互作实验送样说明
2023-05-06
细胞送样说明
2023-05-06
组学实验送样说明
2023-04-06
血液组成和分离
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实验干货 分享
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