◆技术简介
实时荧光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR或荧光标记的特异性探针，利用荧光信号的积累实时在线监控PCR反应过程，由于在PCR扩增基因的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，可以实现对目的基因在样本中的相对定量或绝对定量。荧光定量PCR不仅实现真正实现了绝对定量，而且具有灵敏度和特异性、高能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，实时荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景十分广阔。
根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质有荧光染料和荧光探针两类，根据使用荧光物质不同，该技术常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。
█ SYBR Green染料法
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█ TaqMan探针法
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SYBR Green I是目前主要使用的荧光染料分子，SYBR Green I是一种能与DNA双链小沟的特异性结合染料。游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，而结合双链DNA后，则会发射荧光信号。在荧光定量PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产 物不断积累，荧光信号也会相应的增加，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。 | TaqMan探针是最常用的Real-time qPCR中荧光探针为，根据目的基因设计合成特异性的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。当PCR扩增扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。 |
◆实验方法
实验方法 |  |
① 引物设计：根据目的基因序列分别设计特异性的引物或者荧光探针； ② RNA抽提：提取各样本DNA/RNA、RNA反转录、跑电泳、测浓度； ③ 反转录：去基因组DNA，RNA反转录； ④ RealTime PCR(荧光定量PCR)扩增：配置PCR反应体系，加入模板、引物、染料和dNTP等体系所需的溶液； ⑤ 数据处理，进行扩增曲线、溶解曲线、表达量差异等分析。 | |
数据处理方法 | |
① 检测不同样本待测基因的表达差异，需要通过内参基因的CT值来平衡这些实验差异，获得-△CT值。即：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数。 -△CT=-【Mean（检测基因CT值）-Mean（内参基因CT值）】 ② 对于两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为： -△△CT=-（△CT样本1 -△CT样本2）=-【样本1(检测基因CT-内参基因CT)】-【样本2(检测基因CT-内参基因CT)】。 ③ 数据采用2-ΔΔCt法来计算。 |
◆服务内容
服务类型 | 客户提供 | 服务内容 | 周期 | 价格 |
RT-qPCR 相对定量 | ² 实验样本 ² 实验信息表 | Ø 引物设计 Ø RNA抽提和反转录 Ø 上机PCR检测 Ø 数据实验报告 | 5-6周 | |
RT-qPCR 绝对定量 | ² 实验样本 ² 实验信息表 | Ø 引物设计 Ø 标准品制备和标准曲线制备 Ø RNA抽提和反转录 Ø 上机PCR检测 Ø 数据实验报告 | 5-6周 |
◆结果展示
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◆服务流程
◆ 样本类型
1. RNA样品
提供的RNA总量不低于10ug，浓度不低于200ng/ul，尽量大于500ng/µl。A260／280应在1.8-2.0之间。需提供RNA质量检测图，变性凝胶电泳应呈现两条清晰的带。样本放入-80℃冰箱中贮存，干冰运输。
2. 组织样品
组织离体15分钟内，立即将其用消毒过的刀具切成黄豆大小（直径约0.5cm）的小块，用PBS或生理盐水洗净血液、体液等影响实验结果的残留成分。随后将样本小块置于液氮中速冻，放入EP管中保存，再放入-80℃冰箱中或者液氮罐中保存，干冰运输。
3. 细胞
3.1 贴壁细胞
吸净培养容器中的培养基，并加入PBS，用细胞铲将细胞刮入离心管中（或加入适量PBS清洗1次细胞后用胰酶消化细胞，加入血清终止反应后收集于离心管中），离心去掉上清，再加入PBS清洗细胞2次，离心后样本放入液氮或-80度冰箱中保存，细胞总量不低于107个。
如果要裂解样本，吸净培养容器中的培养基，并加入PBS洗几次后弃去PBS，加入适当体积的裂解液（依据裂解液说明书），用细胞铲将细胞刮入裂解液中。将细胞裂解液转移到样品管中。
3.2 悬浮细胞
将细胞悬液转移至样品管中，离心弃掉上清。去除上清后用PBS清洗细胞2-3次，直至把所有的培养基去除干净；将离心后的细胞放入液氮或-80℃冰箱中保存。细胞总量不低于107个。
样本放入-80度冰箱中暂存。加入适当体积的裂解液（依据裂解液说明书）。反复吹吸直至清亮。
4. 细菌悬液
将细菌悬液转移至样品管中离心，去除上清培养基，再用PBS清洗三次，清洗干净后，将菌体沉淀转移至1.5ml的EP管中，封口膜封口，管子上做好标记，将样品放入-80℃冰箱中保存，干冰运输。
如果要裂解样本，加入适当体积的裂解液（依据裂解液说明书）。反复吹吸直至清亮。
5. 血液样品
5.1 全血
采集新鲜血液放置抗凝管或血袋中保存，样本量大于2ml，需当天送达，4℃运输。或者新鲜血液分离白细胞，分离后的白细胞样本放入-80℃冰箱中保存，干冰运输。
如需提取RNA，建议采用专用的全血样品RNA提取试剂盒抽提RNA，如QIAamp RNA Blood Mini Kit。
5.2 血清
使用非抗凝管（或无热原无内毒素的离心管）采集血液样本，室温下静置1-3个小时不等或4℃静置过夜使其自然凝固，2000-3500转/分4℃低温离心10-20min，吸取收集上清，血清需要量为200ul，如量较多建议分装保存，避免反复冻融，-80℃冰箱中保存，干冰运输。
如需裂解样品，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入-80℃冰箱保存，干冰运输。
5.3 血浆
使用抗凝管（可根据样本选择EDTA、肝素钠、柠檬酸钠或枸橼酸纳作为抗凝剂）采集血液样本，混合10-20分钟后，2000-3000转/分4℃条件离心20分钟（或4000转/分离心5min），仔细吸取收集上层液体，血清需要量为200ul，如量较多建议分装保存，避免反复冻融，-80℃冰箱中保存，干冰运输。
如需裂解样品，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入-80℃冰箱保存，干冰运输。
