▉ 技术简介
microRNA（miRNA）是一种内源性的小RNA分子，在参与真核生物调控发育过程中起着重要的作用。其最常见的调控功能是通过碱基互补配对的方式结合靶基因mRNA的3’UTR区，引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译使其蛋白水平下降。荧光素酶是以萤火虫荧光素酶（firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（ Renilla Luciferase ）为报告基因，荧光素酶的催化下，荧光素底物发生氧化反应，从而产生荧光。通常其中一个荧光素酶基因作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响，比如细胞数目及活力的差异，细胞转染及裂解效率。
结合双荧光素酶报告系统，检测miRNA对靶基因的结合情况，是目前最常用的一种方法。该技术将预测靶基因的3’UTR构建到pCHECK2.0载体（含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因）上，同时合成miRNA mimics，两者共转染细胞，一定时间后裂解细胞，通过双荧光素酶试剂盒检测萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶的发光值，判断miRNA是否能结合3’UTR并调控其表达。
▉ 实验流程
1.报告基因载体构建：将目的基因构建至双荧光素酶报告基因载体的上，目的片段位于荧光基因的下游，如构建至psiCHECK™-2载体中hRluc基因的下游。miRNA一般可以直接通过合成miRNA 对应的模拟物mimics即可，不需要再另外构建载体。
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2. 细胞转染：将荧光素酶报告质粒与内参质粒和Mimics共转染细胞，由于内参的启动子活性较强，通常报告质粒与内参质粒的转染比例为10：1，Mimics的使用终浓度是100nM。报告质粒载体用的psiCHECK™-2，该载体上已经有内参基因，不需要再转染内参质粒。
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3.收集细胞：将裂解液加入细胞孔中，摇床常温条件下摇晃适当时间后进行离心，将上清转移到新的管子中。 |
4. 双荧光素酶报告基因活性检测：96 孔酶标版中加入20 ul细胞裂解液上清，加入100ul LARII，混匀，读取读数，即为Firefly luciferase的数值；每孔再加入100ul 的STOP&GLO Reagent，再次测定数据，即为Renilla luciferase的数值。
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5. 数据处理：首先将Renilla luciferase/Firefly luciferase得出比值，再均一化对照组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性。 |
▉ 服务内容
服务类型 | 客户提供 | 服务内容 | 周期 | 价格 |
双荧光素酶报告基因检测miRNA靶标 |
ü miRNA与靶基因结合位点 ü 靶基因模板（或委托我司合成） ü 实验用细胞（若选用293T细胞无需提供） ü 实验信息表
| ² 靶基因野生型载体构建 ² 靶基因突变型载体构建 ² miRNA mimics合成 ² 细胞转染 ² 双荧光素酶活性检测 ² 出具实验报告 | 5-6周 |
▉ 结果展示
