载体构建案例
成功案例
2023-04-27
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 以SP1(NCBI Reference Sequence: NM_013672,2346bp)载体构建为例,展示我们的实验设计和服务内容。





 

实验目的


本实验主要是为了实现对小鼠SP1的过表达载体构建,后期要对该基因在小鼠的细胞中进行定位研究。






载体选择


针对该实验目的,得出结论对载体有3点要求:


1. 由于要进行定位研究,下游实验建议进行稳定细胞株构建,故我们选择慢病毒载体,以便下游可以进行慢病毒包装和稳定表达细胞株构建;

2. 同时需要选择一个含有与目的基因可以融合表达荧光基团,便于定位研究;

3. 含有抗性筛选基因,方便下游稳定细胞株筛选可用药物进行抗药性筛选,故我们选择了pLVX-mCherry-N1载体。




 11.jpg

该载体是慢病毒表达载体,主要的骨架结构是CMV-MCS-mCherry-PGK-puro,SP1基因与mCherry红色荧光融合表达,同时还含有PURO抗性筛选基因。






选择酶切位点和引物设计


为了将目的片段与载体连接,需要目的基因与载体带上相同的限制性内切酶位点,酶切位点的选择,主要有以下几点原则:

●  酶切位点需要存在于载体的MCS,但同时不能存在于目的基因序列中;

 两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔,不能紧邻或重叠;

最好选择成熟的内切酶;

 ● 双酶切后末端不会发生自连


根据以上几点原则,我们选择了XhoI和EcoRI限制性酶切位点。由于需要将SP1目的基因扩增出来,需要进行引物设计,设计的引物序列如下:

SP1-XhoI-F: gatctcgag gccacc atgagcgaccaagatcac   

SP1-EcoRI-R:gcagaattcgaaaccattgccactgatatt   




PCR扩增


以小鼠胚胎成纤维细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因,在目的基因两端分别引入XhoI EcoRI的酶切位点,PCR反应条件和程序如下:

试剂

用量

cDNA Template

2ug

上游引物(10μM)

1μL

下游引物(10μM)

1μL

PrimeSTAR Max (2X)

10μL

ddH2O

7μL

总体积

20μL

 

反应程序条件:

温度

反应时间

循环数

94 °C

5 min

1Cycles

94 °C

30 sec

25   Cycles

60 °C

30 sec

72 °C

30 sec

72 °C

3min

1Cycles

16 °C


 

PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,DNA凝胶回收试剂盒胶回收目的基因DNA条带(2343bp)。







目的基因片段和载体双酶切


对SP1基因PCR产物和pLVX-mCherry-N1质粒载体进行XhoI和EcoRI双酶切,酶切反应在37℃水浴反应3h;

酶切反应体系(基因PCR产物):


酶切反应体系(载体):

试剂

用量


试剂

用量

10X K Buffer

5 µL


10X K Buffer

5 µL

PCR产物

15 µL


目的载体

5ug

XhoI

1.5 µL


XhoI

1.5 µL

EcoRI

1.5 µL


EcoRI

1.5 µL

ddH2O

27 µL


ddH2O

27 µL

37℃酶切3h


37℃酶切3h

反应结束后,将产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳,按照DNA凝胶回收试剂盒胶回收目的基因DNA片段和目的载体片段。






目的基因与载体连接


质粒pLVX-mCherry-N1酶切回收片段与目的基因连接,连接反应在16℃反应过夜。连接的反应体系如下:

试剂

用量

酶切回收的载体

100ng

酶切回收的PCR产物

100ng

10X T4 Buffer

2μL

T4 连接酶

1μL

ddH2O

补充到20μL

总体积

20μL

16℃ 连接过夜



 



转化


取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min,42℃热激60s,立即置冰上放置2min, 加入预热至室温的300ul LB培养基, 37℃恒温摇床培养1h。吸取菌液,用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上, 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。






挑取菌落PCR验证和测序验证


挑取数个菌落,用记号笔做好标记,用枪头将菌液蘸取少量放置配置好的体系中,进行PCR验证,反应体系如下:

试剂

用量

菌液

2ug

上游引物(10μM)

1μL

下游引物(10μM)

1μL

PrimeSTAR Max (2X)

10μL

ddH2O

7μL

总体积

20μL

 

反应程序条件:

温度

反应时间

循环数

94 °C

5 min

1Cycles

94 °C

30 sec

25   Cycles

60 °C

30 sec

72 °C

80 sec

72 °C

3min

1Cycles

16 °C


 

PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,对照Marker大小,选取正确的菌落加入含3ml,100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中,300rpm,37℃恒温摇床培养过夜,用质粒小量提取试剂盒按照说明书提取质粒,再进行测序验证。






酶切鉴定分析


对构建成功的克隆进行酶切检测,根据酶切的片段大小是否符合预期大小,酶切反应体系是:

试剂

用量

10X K Buffer

2 µL

载体

2ug 

XhoI

o.5 µL

EcoRI

o.5 µL

ddH2O

补充至20µL

37℃酶切3h

 

PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,对照Marker大小,判断是否符合预期,以下是酶切的电泳结果图:

图片2.png

根据marker的大小,可知酶切出的条带符合预期大小,条带的大小分别为8787(载体大小)和2355(SP1含酶切位点大小)






测序分析


对测序结果进行拼接,得到以下序列,序列经过软件与SP1目的基因序列进行比对,可以100%比对上。测序得到的序列如下:

CGCAAATGGGAGCATATAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGGCCACCATGAGCGACCAAGATCACTCCATGGATGAAGTGACAGCTGTGGTGAAGATTGAAAAAGATGTTGGTGGCAATAATGGGGGTAGCGGCAATGGTGGCGGTGCCGCCTTTTCTCAGACTCGAAGCAGCAGCACAGGCAGTAGCAGCAGCAGTGGTGGCGGAGGAGGGCAGGAATCCCAGCCATCTCCTTTGGCTCTGCTGGCAGCAACCTGCAGCAGAATTGAGTCACCCAATGAGAACAGCAACAACTCCCAGGGTCCGAGTCAGTCAGGGGGCACAGGTGAACTTGACCTCACAGCCGCACAACTTTCACAGGGTGCCAATGGCTGGCAGATCATCTCTTCCTCCTCTGGGGCTACCCCTACCTCAAAGGAACAGAGTGGCAACAGTACCAATGGCAGCGAGTCTTCCAAGAACCGCACAGTCTCTGGTGGGCAGTATGTTGTGGCTGCTACCCCCAACTTACAGAACCAGCAAGTTCTGACAGGTCTCCCTGGAGTAATGCCTAATATTCAGTATCAAGTAATCCCACAGTTCCAGACTGTTGATGGGCAGCAGCTGCAGTTTGCTGCCACTGGGGCCCAAGTGCAGCAGGATGGTTCTGGTCAAATACAGATCATACCAGGTGCAAACCAACAGATCATCCCAAATAGAGGAAGTGGGGGCAACATTATTGCTGCTATGCCAAATCTACTCCAGCAGGCTGTCCCCCTTCAAGGCCTTGCTAATAATGTGCTCTCAGGACAGACTCAGTATGTGACCAATGTACCAGTGGCCCTGAATGGGAACATCACCTTGCTACCTGTCAACAGCGTTTCTGCAGCTACCCTGACTCCCAGCTCTCAGGCAGGCACTATCAGCAGCTCTGGATCCCAGGAGAGCAGCTCACAGCCTGTCACCTCAGGGACTGCCATCAGTTCTGCCAGCTTGGTGTCATCACAAGCTAGTTCCAGCTCCTTTTTTACCAATGCCAATAGTTATTCAACAACTACTACCACCAGCAACATGGGAATTATGAACTTTACCAGCAGTGGCTCATCAGGGACTAGTTCTCAAGGCCAGACGCCCCAGAGGGTTGGTGGGCTACAAGGGTCTGATTCTCTGAACATCCAGCAGAACCAGACATCAGGAGGCTCGCTGCAAGGAAGTCAGCAGAAAGAGGGAGAGCAAAGTCAGCAGACACAGCAACAACAAATTCTTATTCAGCCTCAGCTAGTTCAAGGAGGACAAGCTCTTCAGGCCCTTCAAGCAGCACCATTGTCCGGACAGACCTTCACAACTCAAGCTATTTCCCAGGAAACCCTTCAGAACCTCCAGCTTCAGGCTGTTCAAAACTCTGGTCCCATCATCATTCGGACACCAACCGTGGGGCCCAATGGACAGGTCAGTTGGCAGACCCTTCAGCTGCAGAATCTTCAAGTTCAGAACCCACAAGCCCAGACAATCACCTTGGCCCCTATGCAGGGTGTTTCCTTGGGGCAGACTAGCAGCAGTAATACCACCCTAACACCCATTGCCTCAGCTGCCTCCATTCCTGCTGGCACAGTCACTGTGAATGCTGCTCAACTCTCCTCCATGCCAGGCCTCCAGACCATTAACCTCAGTGCATTGGGTACTTCAGGGATCCAGGTGCACCAGCTTCCAGGCCTGCCTTTGGCTATAGCAAACACCCCAGGTGATCATGGAACTCAACTTGGTCTTCATGGATCTGGTGGTGATGGGATACATGATGAGACAGCAGGTGGAGAAGGAGAGAATAGCTCTGATCTCCAACCCCAAGCTGGACGCAGGACTCGTCGGGAAGCATGTACATGCCCCTATTGCAAAGACAGTGAGGGAAGAGCCTCAGGAGATCCTGGCAAAAAGAAACAGCACATTTGTCACATCCAAGGATGCGGCAAAGTATATGGCAAGACCTCACATCTCCGAGCACACTTGCGCTGGCATACAGGGGAGAGGCCATTCATGTGTAATTGGTCATATTGTGGGAAGCGCTTTACACGTTCGGACGAGCTTCAGAGACATAAACGTACACATACAGGAGAGAAGAAATTTGCCTGCCCTGAGTGCCCTAAGCGTTTCATGAGGAGTGATCACCTGTCAAAGCATATCAAGACTCACCAGAACAAGAAGGGAGGCCCAGGTGTAGCCCTGAGTGTGGGCACATTGCCCCTGGACAGTGGGGCAGGTTCAGAAGGCACTGCCACTCCTTCAGCCCTTATTACCACCAATATGGTAGCCATGGAGGCCATCTGTCCAGAGGGTATTGCCCGTCTTGCCAACAGTGGCATCAACGTCATGCAGGTGACAGAGCTGCAGTCCATTAATATCAGTGGCAATGGTTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGCCCGGGATGTAGCAGCATTTTCCCCCC

结论: SP1构建于pLVX-mCherry-N1载体的实验完成。

 

 


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