◆技术简介◆
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification) 同位素标记相对和绝对定量技术，是目前运用最广泛的标记定量蛋白组技术之一，借助体外同位素标记物通过与氨基酸N末端氨基以及赖氨酸残基的游离氨基结合，实现对多肽的标记，通过质谱高分辨率质谱仪串联分析方法，高通量的筛选不同样本间总蛋白质组的表达差异。iTRAQ可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，同时兼具灵敏度高、分离能力强、适用范围广、高通量、结果可靠和自动化程度高等优点。iTRAQ 技术已成为目前定量蛋白质组学中一个十分重要的技术，其作用已经在许多生物体和组织研究中得到证明。
◆标记原理◆
iTRAQ试剂由三部分组成：报告基团（Report Group），平衡基团（Balance Group）和肽反应基团（Peptide Reactive Group）。肽反应基团可与肽段N-端或赖氨酸侧链基团发生反应形成共价键从而完成对肽段的标记。目前iTRAQ试剂主要有两种：4-plex和8-plex，可同时标记4组或8组样品。
（1）报告基团为 N-甲基哌嗪部分，作为定量组分或报告离子，出现在 MS\MS 谱 图的低质量区，共有8种，质量数分别为113-121Da(无120)，因此iTRAQ 试剂可最多同时标记8 组样品；
（2）平衡基团的质量分别为192-184Da(无185)，与报告部分相互配合，使得itraq试剂分子量均为305 Da，保证iTRAQ试剂标记的不同样本同一肽段具有相同的质荷m/z比；
（3）肽反应基团为 N-羟基二酰亚胺，将iTRAQ试剂与肽段上N端氨基酸残基以及赖氨酸相连，在其上报告基团通过平衡基团与反应基团相连，形成等量异位标签。
◆ 实验原理 ◆
◆ 实验流程 ◆
①
收集样本并分别对样本进行蛋白质提取定和定量；
②
对蛋白质进行还原、封闭后进行酶解，得到多肽混合物；
③
用iTRAQ试剂对各组样本的肽段混合物进行标记，使不同iTRAQ试剂标记样品中的所有肽，并等量混合各组标记后的多肽样本；
④
对混合后的多肽样品进行RPLC-MS反相色谱-串联质谱检测及分析。 在一级质谱图中，不同iTRAQ同位素标记的同一肽段后分子量完全相同，所以不同来源的同一蛋白同一标记肽段在一级质谱图中呈现相同；
⑤
收集一级质谱图中同一个峰的样品，得到不同样品的相同肽段混合物，进行二级质谱，得到二级质谱图。此时报告基团、平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，平衡基团丢失，带不同同位素标记的同一多肽产生质量为113，114，115，116，117，118，119和121Da的报告离子（8-plex），报告离子呈现出不同的峰。
⑥
将波峰的高度面积等相关数据经过软件处理，结合数据库对比分析，可获得不同样品间相同肽段的定量信息。
◆ 服务流程◆
◆ 技术优势 ◆
灵敏度高，可检测出低丰度蛋白；
自动化程度高，液质连用，自动化操作，分析速度快
可标记修饰后的氨基酸，因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性定量研究。
分离能力强，可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；
定性与定量可同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；
可同时对2-8个样本进行分析，操作简单快速，减少多次质谱检测中产生的系统误差。适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析，实验设计更加灵活。
iTRAQ是在肽段水平上进行的体外标记，适用于多种类型的生物样本，可标记各种动物组织、植物组织、微生物、血浆、体液、细胞培 养物、等样本，也可对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。
